Übersicht

Als Chromatografie bzw. Chromatographie (griechisch, zu deutsch Farbenschreiben) wird ein Verfahren bezeichnet, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Komponenten zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ermöglicht. Dieses Prinzip wurde 1901 von dem russischen Botaniker Michail S. Tswett beschrieben. Im Jahr 1906 benutzte er erstmals den Begriff „Chromatographie“. In seinen Arbeiten untersuchte Tswett gefärbte pflanzliche Extrakte, zum Beispiel aus Blattmaterial und konnte daraus durch Chromatographie verschiedene Farbstoffe isolieren. Man unterscheidet heute zwischen analytischer und präparativer Chromatographie. Praktische Anwendung findet diese Methode in der Produktion zur Isolierung bzw. Reinigung von Substanzen. In diesem Fall spricht man von präparativer Chromatographie. In der chemischen Analytik nutzt man die Chromatographie, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltsstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen.

Das Prinzip

In der Chromatographie werden Substanzgemische in einer sogenannten mobilen Phase auf einer stationären Phase weitertransportiert. Die Komponenten werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Wechselwirkung zwischen der stationären und mobilen Phase unterschiedlich schnell weitertransportiert und dadurch aufgetrennt. So wie sich in einem Flussbett Sand und Kieselsteine unterschiedlich schnell transportiert werden, so sorgt die zeitliche Verteilung der Substanzen in der mobilen und stationären Phase bei der Chromatographie zu den Geschwindigkeitsunterschieden im Weitertransport und somit zu einer Auftrennung der Gemische.

Der Prozess

In der Chromatographie benötigt man die mobile Phase, die fließt (hydraulischen Pumpe, Gasdruck, Kapillarkraft, elektrische Spannung), eine Stelle, bei der die Probe eingebracht wird (Injektion) und eine Detektion der getrennten Bestandteile. Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatographische System) erfolgt entweder bevor der Fluss der Mobilen Phase hergestellt wird (z. B. Dünnschichtchromatographie) oder während die mobile Phase bereits fließt. Anschließend geschieht die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Wichtig ist nun die Detektion der aufgetrennten Substanzen. Unter Detektion versteht man das Sichtbar machen d.h. zu welchem Zeitpunkt eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatographiesystems passiert.

Detektion

Für die unterschiedlichen Typen der Chromatographie werden verschiedene Detektionsysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit ..) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z.B. eine Färbung bei der planaren Chromatographie erreicht (z.B. Aminosäuren mittels Ninhydrin) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatographie durchgeführt.

Methoden der Chromatographie in Bezug auf die verwendeten Phasen

Adsorptions-Chromatographie Die Trennung der verschiedenen Komponenten beruht auf den unterschiedlich starken adsorptiven Bindungen zur ruhenden Phase. Die bewegte Phase kann ein mehr oder weniger polares Lösungsmittel oder bei gasförmigen Stoffen ein Trägergas sein. Im Fall der Flüssigchromatographie stellt man sich einen Gleichgewicht zwischen den diversen Probemolekülen mit den Molekülen der mobilen Phase (Fließmittel, Laufmittel) und den Haftstellen auf der (großen) Oberfläche der stationären Phase ein.

Verteilungs-Chromatographie Bei dieser Art der Chromatographie wird die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden Komponenten in der mobilen und stationären Phase ausgenutzt. Die stationäre Phase ist stets eine Flüssigkeit, welche jedoch an ein festes Trägermaterial gebunden und somit unbeweglich ist. Die bewegte Phase kann wieder eine Lösung (man spricht dann von LLC, englisch: liquid liquid chromatography) oder ein Trägergas (GLC, englisch: gas liquid chromatography) sein.

Man unterscheidet bei der Ionenaustausch-Chromatographie zwischen Anionenaustausch-Chromatographie und Kationenaustausch-Chromatographie. Die bewegte Phase ist hier meist eine Lösung der zu trennenden Ionen. Die ruhende Phase ist ein fester Ionenaustauscher. Ionenaustauscher bilden zwischen den verschiedenen Ionen der bewegten Phase unterschiedlich stabile Bindungen aus. Am häufigsten wird als Detektor ein Leitfähigkeitsdetektor eingesetzt, daneben werden noch UV/VIS-, amperometrische und Fluoreszenz-Detektoren verwendet.

Siebwirkung Bei der ruhenden Phase benutzt man Stoffe, die die Komponenten anhand ihrer Größe trennen. Im Wesentlichen unterscheidet man hier zwischen drei Verfahren:

- Molekularsieb-Chromatographie
- Gel-Permeations-Chromatographie
- Ausschluss-Chromatographie

Bei diesen Arten der Chromatographie verteilen sich kleinere Moleküle eher in die Hohlräume der stationären Phase und sind daher langsamer unterwegs als Moleküle, die auf Grund ihrer Größe aus diesen Hohlräumen ausgeschlossen werden. Bei genügender Größe wandern sie nahezu unverzögert.

Affinitäts-Chromatographie Als stationäre Phase wird eine für jeden Analyten spezifische chemische Verbindung eingesetzt, die auf Grund nichtkovalenter Kräfte eine Trennung bewirkt. Es handelt sich hierbei um eine hochselektive Methode.

IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) Hierbei werden über Komplexbindungen Metallionen wie Fe, Co, Ga u. a. an eine Matrix gebunden. Die Trennung wird über die unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und den Metallionen erreicht.

Einteilung nach den verwendeten Phasen

Planare Chromatographie

Papierchromatographie Die verwendete stationäre Phase ist Papier, das flach oder (meist) vertikal in einen Glasbehälter gelegt wird. Wie bei der Dünnschichtchromatographie bewegt sich die mobile Phase aufgrund von Kapillarkräften.
Dünnschichtchromatographie Die verwendete stationäre Phase besteht beispielsweise aus Silica-Partikeln, die in Form einer feinen Schicht auf eine flexible Trägerfolie aus Aluminium oder Kunststoff- oder Glasplatten aufgebracht werden. Eine Variante ist die zirkuläre DC mit einer rotierenden beschichteten Scheibe (besonders geeignet für Präparationszwecke).

Säulenchromatographie

Niederdruckchromatographie Die hier verwendeten Säulen haben einen Durchmesser von einem bis mehreren Zentimetern. Diese Form der Flüssigkeitschromatographie wird hauptsächlich für präparative Trennungen verwendet.
HPLC (High Performance Pressure Liquid Chromatography) Diese ist heute die gebräuchlichste Trennmethode in der analytischen Arbeit. Tatsächlich bezieht sich der falsche (veraltete) Begriff Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf die Drücke, die diese Methode von Niederdruck- oder anderen Arten der Chromatographie unterscheiden. Immerhin werden hier bis zu 400 bar bei einem Laufmittelfluss von bis zu 5 ml/min erzeugt, was allerdings nichts mit der Trennleistung zu tun hat, sondern lediglich dazu dient, das Eluentengemisch durch die Säule zu bewegen.
Elektrochromatographie Dabei wird die mobile Phase durch Anlegen einer Spannung bewegt. Diese Methode befindet sich noch in der Entwicklung und wird im Routinebetrieb nicht eingesetzt. Nicht zu verwechseln mit Elektrophorese.

Membranchromatographie

Membranchromatographie Anstelle einer mit einer chromatographischen Matrix gefüllten Säule wird als Festphase eine Mono- oder Multilayer-Membran in einem geeigneten Gehäuse verwendet. Die mobile Phase wird bei niedrigem Druck bis 6 bar und etwa 20-fach höheren Flussraten als für die Säulenchromatographie üblich, durch die Membran gepumpt.

Gaschromatographie

Gepackte Säulen Das Innere der Säule (lange Röhre) ist mit feinkörnigem Material gefüllt. Die stationäre Phase besteht in der Regel aus einer dünnen Schicht weitgehend inerter und hochsiedender Flüssigkeit, die die Pulverkörner bedeckt.
Kapillarsäulen Nur die Säulenwand ist mit einer dünnen Schicht aus stationärer Phase bedeckt.

Trennstufenhöhe H

Der Trenngrad einer Chromatographiesäule ist ein Maß für die Trennleistung der Säule. Als Trennschritt kann man sich einen Abschnitt der Trennsäule vorstellen, an dem sich einmal das chromatographische Gleichgewicht eingestellt hat. Je mehr solche Gleichgewichtseinstellungen auf der Säule stattfinden, desto geringer ist die Höhe des Trennschrittes und desto höher die Trennleistung der Säule. Um unter analytischen Bedingungen eine geringe Plattenhöhe zu erreichen, sind folgende Voraussetzungen notwendig:

- Es wird eine schnelle Gleichgewichtseinstellung der Adsorption oder Verteilung erwartet. Aus diesem Grund sollte der Teilchendurchmesser so klein wie möglich sein
- Konstante Temperatur in der vollständigen Säule: Hierbei kann ein Säulenthermostat benutzt werden.
- Konstante Fließgeschwindigkeit: Dafür wird eine Kolbenpumpe mit bis zu 400 bar verwendet.
- Linearer Adsorptionsbereich: Die stationäre Phase sollte im Verlauf der Chromatographie nicht überladen werden.
- Vernachlässigbare Diffusion wäre wünschenswert, ist aber experimentell leider nicht erreichbar. Es werden infolgedessen möglichst regelmäßige Packungen mit Teilchen von außerordentlich kleinem Durchmesser verwendet.


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Meter Säulenlänge bei der Gaschromatographie
Bar maximaler Druck bei der HPLC
Entdeckungsjahr der Chromatographie